由于存在三维交联网络结构，硫化橡胶废物的处理非常困难。本文报告了一种名为Acinetobacter sp. BIT-H3的细菌，它从食用塑料的黄粉虫肠道中分离出来，可以在硫化聚（顺-1,4-异戊二烯）橡胶（vPR）上生长和并降解vPR。扫描电子显微镜（SEM）显示，菌株BIT-H3可以渗透到vPR中并使其产生弹坑和裂缝。经过十周的孵育，vPR的拉伸强度和交联密度分别下降了53.2%和29.3%。光谱结果分析表明：菌株BIT-H3可以同时破坏vPR中聚合物主链中的硫桥和双键，降解过程中释放出硫酸盐和具有末端醛基和酮基的顺-1,4-异戊烯低聚物。

聚异戊二烯橡胶（Poly(cis-1,4-isoprene)是天然橡胶的主要成分，由顺式构型的-CH₂-C(CH₃)=CH-CH₂-重复单元组成。为了提高橡胶产品的弹性和耐久性，天然橡胶的线性聚异戊二烯链通过硫桥以共价交联的方式进行硫化，形成硫化聚异戊二烯橡胶（Vulcanized poly(cis-1,4-isoprene)rubber, vPR）。vPR广泛应用于汽车轮胎和一般橡胶制品制造，全球消费量已达约1390万吨/年。尤其在COVID-19流行期间，一次性医用手套的大量需求导致vPR产品消费量急剧增长约10%。vPR废料丢弃到自然环境中会导致严重环境污染,但现有的填埋、焚烧和再利用等处理方法都不够环保。因此，探索更可持续的橡胶废物处理方法迫在眉睫。

微生物降解橡胶成为一种环保的替代方案。已发现几种微生物能够通过分泌橡胶氧合酶（Lcp、RoxA和RoxB）、漆酶或过氧化物酶来裂解顺式-1,4-异戊二烯链的双键，从而降解非硫化聚异戊二烯橡胶。本研究首次发现一种名为BIT-H3的不动杆菌，能以硫化聚异戊二烯为唯一碳源生长，通过对培养后的vPR理化性质变化分析及BIT-H3菌株的基因组和转录组分析，提出BIT-H3菌株的vPR生物降解途径，为开发硫化橡胶废物生物降解方法提供新的可能。

1. vPR降解菌株BIT-H3的筛选

这项研究利用黄粉虫肠道内容物作为接种物，通过使用硫化聚异戊二烯作为主要碳源进行生长，获得了一组微生物富集物。通过在LB琼脂平板上进行限制稀释，从这组富集物中成功分离出六种不同种类的细菌菌株。随后，在MSM培养基中，以硫化聚异戊二烯为主要碳源进行生长，对这些菌株进行了初步筛选。经过十周的孵育后，发现只有一种菌株（命名为菌株BIT-H3）表现出明显的生长。因此，菌株BIT-H3被选为具有潜在降解硫化聚异戊二烯能力的微生物进行进一步研究。根据菌株BIT-H3的形态特征和16S rDNA测序结果，可以确定该菌株属于不动杆菌属，因此提议将其命名为不动杆菌属BIT-H3种。

2. 菌株 BIT-H3 在 vPR 上的生长情况

为了证实菌株BIT-H3能够降解硫化聚异戊二烯并以此为唯一碳源生长的能力，这项研究进行了重量损失分析和菌株BIT-H3在有无硫化聚异戊二烯作为唯一碳源情况下的蛋白质产量测定。在进行生物降解实验之前，首先使用丙酮和氯仿对用过的硫化聚异戊二烯碎片进行提取，去除了可溶的低分子量杂质，以确保菌株Acinetobacter sp. BIT-H3降解的是硫化橡胶而不是低分子量杂质（如低分子量单体、低聚物和有机化学添加剂等）并将其作为唯一碳源进行生长。

图2a显示了接种或不接种菌株BIT-H3的硫化聚异戊二烯碎片的重量损失变化。在培养期间，接种的硫化聚异戊二烯碎片的重量损失持续增加，而未接种的对照重量损失可忽略不计。十周后，接种菌株BIT-H3的硫化聚异戊二烯碎片的最大重量损失达到12±1.1%，这与之前报道的三种革兰氏阴性橡胶降解细菌菌株Xanthomonas sp.、Pseudomonas citronellolis和Acinetobacter calcoaceticus对硫化乳胶手套所造成的重量损失相似。这一结果表明，接种橡胶碎片的重量损失可以归因于菌株BIT-H3的生物学活性，而不是非生物过程。

图2b展示了菌株BIT-H3在有无硫化聚异戊二烯作为主要碳源下的生长蛋白生成过程。当菌株BIT-H3在以硫化聚异戊二烯为唯一碳源的MSM培养基中培养时，培养物的蛋白浓度在十周培养后增加到406±19μg/mL。相比之下，在不添加硫化聚异戊二烯和其他有机营养物质的对照培养物中，菌株BIT-H3的蛋白浓度在整个培养时间内保持在较低水平（50μg/mL）。基于蛋白产量和重量损失的结果，菌株BIT-H3以硫化聚异戊二烯碎片作为唯一碳源培养的蛋白产量估计为0.67±0.01g蛋白/g橡胶碎片。这表明菌株BIT-H3能够将硫化聚异戊二烯作为碳源用于蛋白合成。

此外，通过扫描电子显微镜观察菌株BIT-H3在硫化聚异戊二烯碎片上的生长和降解能力。如图2c所示，未接种的培养物表面光滑，没有缺陷。相比之下，接种了菌株BIT-H3的培养物表面，菌株BIT-H3的细胞侵入硫化聚异戊二烯碎片中并形成多个菌落坑（直径约10~20μm）。图2d至图2h分别表示1、2、3、6、10周的菌坑变化：经过十周的培养，凸起结构形成大量小颗粒状突起，并出现明显的裂纹（图2h）。这些观察结果明确表明，菌株BIT-H3不仅能够在硫化聚异戊二烯碎片表面粘附生长，还能导致其显著分解。

3. 应变BIT-H3对vPR的解交联

菌株BIT-H3降解vPR的能力进一步通过检测接种有或没有菌株BIT-H3后剩余vPR的力学性能和化学结构变化进行验证。

首先，对有或没有接种菌株BIT-H3的vPR片进行拉伸强度测试，以确定力学性能的变化。如图3a所示，接种菌株BIT-H3的样品拉伸强度从78.2±4.2 MPa急剧下降到36.6±1.2 MPa，最大拉伸强度损失率达到约53.2%。相比之下，未接种的培养物的拉伸强度在十周的孵育时间内几乎没有变化。

此外，为了确定菌株BIT-H3破坏了交联网络结构的哪一部分（聚合物链或硫桥），根据硫化橡胶降解过程中溶胶分数与交联密度的理论关系进行了Horikx分析（SI，M1）。如图3c所示，虚线表示聚合物主链断裂，实线表示硫桥断裂。接种菌株BIT-H3的实验样品位于两条曲线之间的空间内，但并不靠近其中任何一条曲线。这一观察结果表明，在降解过程中聚合物主链和硫桥同时断裂。接下来，使用ATR-FTIR光谱进一步证实了菌株BIT-H3在降解过程中同时破坏了聚合物主链和硫桥。在分析之前，样品表面上的微生物生物膜已被清除。

4. 应变BIT-H3从vPR解交联释放产物

硫酸盐是切割硫化橡胶交联硫桥后得到的最终代谢产物。为了进一步证明菌株BIT-H3能够切割聚异戊二烯主链的-C=C-键和vPR中的交联硫桥，分析了培养期间释放的有机和无机产物。

如图4a所示，接种培养物的硫酸盐浓度在十周培养期内显著增加。十周后，硫酸盐浓度最高达到513.8±11.1 mg/L。然而，未接种培养物的硫酸盐浓度在整个培养时间内保持不变。这一结果表明，菌株BIT-H3能够切割vPR的硫桥，并将切割后的硫桥转化为硫酸盐作为最终产物。如图4b所示，接种vPR培养物的1H NMR谱图中在5.15 ppm、2.07 ppm和1.71 ppm处出现了峰值（分别用数字1、2和3在图4d中标出），这些峰值分别代表聚（顺-1,4-异戊二烯）结构中的烯烃质子（=CH-）、亚甲基质子（-CH2-）和甲基质子（-CH3）。在9.69 ppm和2.23 ppm处出现的两个小信号可归因于末端醛基的质子。

5. 脱硫酶和橡胶加氧酶编码基因的鉴定和转录

已知微生物脱硫途径，也称为4S途径，由dsz操纵子编码的DszA、DszB和DszC三种酶催化。同时，Lcp、RoxA和RoxB三种橡胶氧合酶以及漆酶和过氧化物酶已被报道能够切割聚（顺-1,4-异戊二烯）链中的双键。为了鉴定与vPR中硫桥和聚合物主链氧化断裂相关的酶的编码基因的同源基因，对菌株BIT-H3基因组进行了测序和功能分析。在菌株BIT-H3基因组中发现了由三个开放阅读框（ORF）组成的dsz-样操纵子。在这个dsz-样操纵子中，第一个ORF是dszA，与Rhodococcus erythropolis XP中的DszA有31.1%的氨基酸（aa）一致性；第二个和第三个ORF分别命名为dszC1和dszC2，与Rhodococcus erythropolis XP中的DszC有26.3%和22.3%的aa一致性。dszC1和dszC2之间的aa一致性为38.8%。该dsz-样操纵子缺少编码DBT-硫酸盐脱氢酶的DszB基因，并且在菌株BIT-H3基因组中未发现其他DszB同源基因。此外，从菌株BIT-H3基因组中恢复了编码漆酶样酶（Laccase 2147）和其他编码过氧化物酶样酶（Peroxidase 1232）的基因，虽没有在基因组中找到已表征的三种橡胶氧合酶Lcp、RoxA和RoxB的同源基因，但Laccase 2147和Peroxidase 1232都携带Sec途径介导的胞外定位信号肽。

为了评估这些基因在菌株BIT-H3降解vPR过程中的作用，对上述五个功能基因的转录表达进行了检测。从图5a中可以看出，在vPR上生长的细胞中，dszA（1425bp）、dszC1（1224bp）、dszC2（1203bp）、Laccase2147（1293bp）和Peroxidase1232（1203bp）的PCR产物呈现出明显的条带，而在葡萄糖上生长的细胞中则没有。相比之下，在葡萄糖或vPR上生长的细胞中，16S rRNA基因的PCR产物都出现了。这表明：在vPR存在的情况下，这五个功能基因dszA、dszC1、dszC2、Laccase2147和Peroxidase1232也被转录。没有进行逆转录反应步骤的对照RNA样本中则没有PCR产物，这表明RT-PCR产物（cDNA的PCR产物）不是来自污染的DNA（图5a）。在葡萄糖之外的vPR存在的情况下，上述五个功能基因的显著转录表明这些基因参与了菌株BIT-H3对vPR的降解。

6. 提出了应变BIT-H3降解vPR的机理

基于以上化学结构变化、代谢产物分析以及功能基因的基因组和转录分析结果，菌株BIT-H3降解vPR的可能机制如图5b所示。

简而言之，vPR的降解过程可以分为三个步骤：脱硫、解聚和同化。在脱硫步骤中，通过“4S”途径，由一系列由dsz操纵子编码的酶作用，硫桥的交联键被打破。起初，dszC1或dszC2催化硫桥的氧化成亚砜桥，然后成砜桥。随后，dszA催化砜桥的断裂，释放出亚硫酸盐（自发氧化成硫酸盐作为最终产物），并形成线性的聚（顺式-1，4-异戊二烯）大分子。

在接下来的解聚步骤中，顺式-1，4-异戊二烯的链被切割成小片段。起初，长链的顺式-1，4-异戊二烯中的C=C双键被Laccase 2147或Peroxidase 1232催化氧化。接着，被氧化的长链顺式-1，4-异戊二烯通过脱氢进一步被切割，导致分子量降低，并产生具有末端酮和醛基的顺式-1，4-异戊二烯低聚物。这种氧化切割过程可能重复多次，生成足够低分子量的低聚物，可以穿过菌株BIT-H3的细胞膜进入细胞。

在同化步骤中，解聚过程产生的小分子寡聚物的醛基可以通过醛脱氢酶进一步氧化成羧酸。同时，解聚过程产生的小分子寡聚物的酮基可以进一步氧化成酯基，酯基可以进一步水解成羧酸和醇。醇被醇和醛脱氢酶进一步氧化成羧酸。根据之前的报道，具有末端羧基的小分子寡聚物可以通过β-氧化降解，产生乙酰辅酶A和丙酰辅酶A，最终进入三羧酸循环（TCA循环），为菌株BIT-H3的生长提供能量和碳源。

在这项工作中，我们首次从塑料食用的幼虫肠道中分离出一种能够以硫化聚异戊二烯橡胶为唯一碳源生长的细菌Acinetobacter sp. BIT-H3。这种肠道细菌被证明能够降解硫化聚异戊二烯橡胶，通过同时切割硫化聚异戊二烯橡胶交联网络中的聚异戊二烯主链中的硫桥和C=C双键。利用基因组和转录分析，我们发现涉及该菌降解硫化聚异戊二烯橡胶的三个基因：dszA、dszC1和dszC2编码脱硫酶，以及两个基因：Laccase2147和Peroxidase1232编码橡胶氧合酶。我们的发现表明，来自塑料食用的幼虫肠道的BIT-H3细菌可以克服三维交联网络结构的障碍，有效降解硫化橡胶。这可能对进一步将该菌应用于处理硫化橡胶废物、对vPR降解过程中释放的产品进行升级再利用，以及改进废弃橡胶颗粒的界面相容性以制造复合材料等方面具有重要意义。

除了硫化聚异戊二烯橡胶外，还有许多其他类型的硫化橡胶产品，其成分各不相同，如苯乙烯-丁二烯橡胶、丁二烯橡胶和氯丁橡胶。由于本研究表明塑料食用的幼虫肠道中的细菌是分离硫化聚异戊二烯橡胶降解菌的有前途的来源，因此需要进一步的工作来探索塑料食用的昆虫幼虫肠道中更多种类的硫化橡胶降解微生物。