聚异戊二烯橡胶（Poly(cis-1,4-isoprene)是天然橡胶的主要成分，由顺式构型的-CH₂-C(CH₃)=CH-CH₂-重复单元组成。为了提高橡胶产品的弹性和耐久性，天然橡胶的线性聚异戊二烯链通过硫桥以共价交联的方式进行硫化，形成硫化聚异戊二烯橡胶（Vulcanized poly(cis-1,4-isoprene)rubber, vPR）。vPR广泛应用于汽车轮胎和一般橡胶制品制造，全球消费量已达约1390万吨/年。尤其在COVID-19流行期间，一次性医用手套的大量需求导致vPR产品消费量急剧增长约10%。vPR废料丢弃到自然环境中会导致严重环境污染,但现有的填埋、焚烧和再利用等处理方法都不够环保。因此，探索更可持续的橡胶废物处理方法迫在眉睫。

微生物降解橡胶成为一种环保的替代方案。已发现几种微生物能够通过分泌橡胶氧合酶（Lcp、RoxA和RoxB）、漆酶或过氧化物酶来裂解顺式-1,4-异戊二烯链的双键，从而降解非硫化聚异戊二烯橡胶。本研究首次发现一种名为BIT-H3的不动杆菌，能以硫化聚异戊二烯为唯一碳源生长，通过对培养后的vPR理化性质变化分析及BIT-H3菌株的基因组和转录组分析，提出BIT-H3菌株的vPR生物降解途径，为开发硫化橡胶废物生物降解方法提供新的可能。

1. vPR降解菌株BIT-H3的筛选

这项研究利用黄粉虫肠道内容物作为接种物，通过使用硫化聚异戊二烯作为主要碳源进行生长，获得了一组微生物富集物。通过在LB琼脂平板上进行限制稀释，从这组富集物中成功分离出六种不同种类的细菌菌株。随后，在MSM培养基中，以硫化聚异戊二烯为主要碳源进行生长，对这些菌株进行了初步筛选。经过十周的孵育后，发现只有一种菌株（命名为菌株BIT-H3）表现出明显的生长。因此，菌株BIT-H3被选为具有潜在降解硫化聚异戊二烯能力的微生物进行进一步研究。根据菌株BIT-H3的形态特征和16S rDNA测序结果，可以确定该菌株属于不动杆菌属，因此提议将其命名为不动杆菌属BIT-H3种。

图2b展示了菌株BIT-H3在有无硫化聚异戊二烯作为主要碳源下的生长蛋白生成过程。当菌株BIT-H3在以硫化聚异戊二烯为唯一碳源的MSM培养基中培养时，培养物的蛋白浓度在十周培养后增加到406±19μg/mL。相比之下，在不添加硫化聚异戊二烯和其他有机营养物质的对照培养物中，菌株BIT-H3的蛋白浓度在整个培养时间内保持在较低水平（50μg/mL）。基于蛋白产量和重量损失的结果，菌株BIT-H3以硫化聚异戊二烯碎片作为唯一碳源培养的蛋白产量估计为0.67±0.01g蛋白/g橡胶碎片。这表明菌株BIT-H3能够将硫化聚异戊二烯作为碳源用于蛋白合成。

此外，通过扫描电子显微镜观察菌株BIT-H3在硫化聚异戊二烯碎片上的生长和降解能力。如图2c所示，未接种的培养物表面光滑，没有缺陷。相比之下，接种了菌株BIT-H3的培养物表面，菌株BIT-H3的细胞侵入硫化聚异戊二烯碎片中并形成多个菌落坑（直径约10~20μm）。图2d至图2h分别表示1、2、3、6、10周的菌坑变化：经过十周的培养，凸起结构形成大量小颗粒状突起，并出现明显的裂纹（图2h）。这些观察结果明确表明，菌株BIT-H3不仅能够在硫化聚异戊二烯碎片表面粘附生长，还能导致其显著分解。

3. 应变BIT-H3对vPR的解交联

菌株BIT-H3降解vPR的能力进一步通过检测接种有或没有菌株BIT-H3后剩余vPR的力学性能和化学结构变化进行验证。

首先，对有或没有接种菌株BIT-H3的vPR片进行拉伸强度测试，以确定力学性能的变化。如图3a所示，接种菌株BIT-H3的样品拉伸强度从78.2±4.2 MPa急剧下降到36.6±1.2 MPa，最大拉伸强度损失率达到约53.2%。相比之下，未接种的培养物的拉伸强度在十周的孵育时间内几乎没有变化。

5. 脱硫酶和橡胶加氧酶编码基因的鉴定和转录

已知微生物脱硫途径，也称为4S途径，由dsz操纵子编码的DszA、DszB和DszC三种酶催化。同时，Lcp、RoxA和RoxB三种橡胶氧合酶以及漆酶和过氧化物酶已被报道能够切割聚（顺-1,4-异戊二烯）链中的双键。为了鉴定与vPR中硫桥和聚合物主链氧化断裂相关的酶的编码基因的同源基因，对菌株BIT-H3基因组进行了测序和功能分析。在菌株BIT-H3基因组中发现了由三个开放阅读框（ORF）组成的dsz-样操纵子。在这个dsz-样操纵子中，第一个ORF是dszA，与Rhodococcus erythropolis XP中的DszA有31.1%的氨基酸（aa）一致性；第二个和第三个ORF分别命名为dszC1和dszC2，与Rhodococcus erythropolis XP中的DszC有26.3%和22.3%的aa一致性。dszC1和dszC2之间的aa一致性为38.8%。该dsz-样操纵子缺少编码DBT-硫酸盐脱氢酶的DszB基因，并且在菌株BIT-H3基因组中未发现其他DszB同源基因。此外，从菌株BIT-H3基因组中恢复了编码漆酶样酶（Laccase 2147）和其他编码过氧化物酶样酶（Peroxidase 1232）的基因，虽没有在基因组中找到已表征的三种橡胶氧合酶Lcp、RoxA和RoxB的同源基因，但Laccase 2147和Peroxidase 1232都携带Sec途径介导的胞外定位信号肽。

为了评估这些基因在菌株BIT-H3降解vPR过程中的作用，对上述五个功能基因的转录表达进行了检测。从图5a中可以看出，在vPR上生长的细胞中，dszA（1425bp）、dszC1（1224bp）、dszC2（1203bp）、Laccase2147（1293bp）和Peroxidase1232（1203bp）的PCR产物呈现出明显的条带，而在葡萄糖上生长的细胞中则没有。相比之下，在葡萄糖或vPR上生长的细胞中，16S rRNA基因的PCR产物都出现了。这表明：在vPR存在的情况下，这五个功能基因dszA、dszC1、dszC2、Laccase2147和Peroxidase1232也被转录。没有进行逆转录反应步骤的对照RNA样本中则没有PCR产物，这表明RT-PCR产物（cDNA的PCR产物）不是来自污染的DNA（图5a）。在葡萄糖之外的vPR存在的情况下，上述五个功能基因的显著转录表明这些基因参与了菌株BIT-H3对vPR的降解。